Optimización de la producción de dextrana a partir de la chancaca mediante el proceso microbiológico que utiliza Leuconostoc mesenteroides
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Date
2006
Authors
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Publisher
Universidad Nacional de Trujillo
Abstract
Se investigó la optimización de la producción de dextrana vía proceso microbiológico, para lo cual se aisló una cepa de Leuconostoc mesenteroides seleccionada como potencial productora de dextrana. Para obtener y evaluar los parámetros de crecimiento, producción y síntesis, se realizaron tres fases por etapas, cada uno bajo condiciones definidas y controladas.
La primera fase experimental estuvo conformado por 3 series de 5 biorreactores rotulados. A cada frasco se le añadió 0,2 g; 0,35 g; 0,5 g; 1,0 g y 2,0 g de extracto de levadura; luego se le adicionó, por igual, 15 g de azúcar rubia (99.9% de sacarosa) y 1,0 ml de sales nutrientes. Se aforó a 100 ml con solución amortiguadora de fosfatos (Na2HPO4/NaH2PO4), diseñado a pH 7,5.
Se esterilizó a 121°C por 15 min, después se enfrió y se inoculó a cada uno 5,0ml de suspensión microbial (semillas) llevándose a incubar, primero a 28°C por 12 horas y luego a 25° para 12 horas más. Posteriormente, se extrajo la dextrana por precipitación añadiéndole 100 ml de alcohol etílico al 96%; se pesó el producto y se determinó que para 15 g de sacarosa/100 ml de solución y 0,5 g de extracto de levadura /100 ml de solución es posible sintetizar 3,175 g de dextrana/100 ml de solución equivalente al 28,2% de rendimiento y un pH final de 5,0.
La segunda fase estuvo conformada por 3 series de 24 biorreactores rotulados. A cada uno se le añadió 0,5 g de extracto de levadura y 15 g de azúcar rubia (99.9% de sacarosa); 1,0 ml de sales nutrientes y aforados a 100 ml con disolución Buffer de fosfatos a pH 7,5; enseguida, se llevó a esterilizar a 121 ºC por 15 minutos: Luego se retiró y enfrió a 25 ºC para sembrar a cada uno con 5,0 ml de inóculo (relación 1:20). Posteriormente, se llevó a incubar a 25°C por 24 horas.
Las extracciones se realizaron cada hora con alcohol etílico al 96% (en proporción 1:1) y se construyó con los datos una curva progreso; Determinándose que transcurridas unas 15 horas de biorreacción existía una máxima en la producción de 3,7 g de dextrana/100 ml de solución, con 33,1% de rendimiento y pH final de 5,4.
En la tercera fase se acondicionaron 3 series de 12 biorreactores rotulados. Al primero se añadió aproximadamente 5,0 g; al segundo 10,0 g; al tercero 15,0 g; al cuarto 20,0 g; al quinto 25,0 g; al sexto 30,0 g; al sétimo 35,0 g; al octavo 40,0 g; al noveno 50,0 g; al décimo 60,0 g; al onceavo 70,0 g y al doceavo 80,0 g; de chancaca triturada (al 86% de sacarosa) respectivamente.
Para que la biosíntesis enzimática se lleve a cabo, previamente, se purificó parcialmente las soluciones diluidas vía precipitación fraccionada con reactivo precipitante (NH4)2 HPO4; seguidamente, se ajustó a pH inicial de 7,5 con NH4OH 0,03 M y se calentó a 75ºC. Luego, se enfrió a 25 ºC, se centrifugó, se filtró y desechó el precipitado.
Al centrifugado se ajustó a pH 5,5 (máxima actividad enzimática) con HCl 0,01 M según el pH final del centrifugado; se esterilizó vía radiación UV (2.650 A) por una hora para evitar la inversión de los azúcares; luego, se añadió 5,0 ml de enzima cruda para posteriormente llevar a incubar a 25°C por 15 horas. Al final de esta etapa se extrajo la dextrana con alcohol etílico al 96%; se pesó el producto, se construyó la curva progreso y se determinó que para 21,5 g de sacarosa por 100 ml de solución (25 g de chancaca), es posible sintetizar 6,2 g de dextrana por 100 ml de solución, con un 28,8% de rendimiento y un pH final de 5,3.
Con el análisis cinético y las leyes de velocidad de Michaelis – Menten, se determinó la eficiencia y especificidad de acción de la enzima (dextransacarasa) frente al sustrato (sacarosa). La gráfica de la ecuación de Lineaweaver – Burk nos proporcionó el valor de la constante Km igual a 0,07 como una medida de la fuerza de atracción entre la enzima y el sustrato ES, el cual produjo una velocidad media de 3,8 x 10-3 µmol de dextrana/min.; es decir que, con 23,9 g de sacarosa (27,8 g de chancaca) la enzima produjo 6,82 g de dextrana/100 ml de solución (26.2% de eficiencia)
A mayores concentraciones de sacarosa, la velocidad de formación del producto alcanza un valor límite debido al fenómeno de saturación del enzima por el sustrato, al final del cual la velocidad máxima es de 8,0 x 10-3 µmol de dextrana/min. Es decir, con 47,8 g de sacarosa (55,6 g de chancaca) se produce 13,6 g de dextrana y con una eficiencia máxima de la enzima en el bioproceso de 28,4% respecto a la sacarosa (24,4% respecto a la chancaca)
Description
We investigated the optimization of dextran production via microbiological process, for which a strain of Leuconostoc mesenteroides selected as a potential producer of dextran was isolated. To obtain and evaluate the growth, production and synthesis parameters, three phases were carried out in stages, each under defined and controlled conditions.
The first experimental phase consisted of 3 series of 5 labeled bioreactors. To each bottle was added 0.2 g; 0.35 g; 0.5 g; 1.0 g and 2.0 g of yeast extract; Then, 15 g of blond sugar (99.9% sucrose) and 1.0 ml of nutrient salts were added. It was adjusted to 100 ml with phosphate buffer (Na2HPO4 / NaH2PO4), designed at pH 7.5.
It was sterilized at 121 ° C for 15 min, then cooled and each inoculated with 5.0 ml of microbial suspension (seeds) and incubated, first at 28 ° C for 12 hours and then at 25 ° C for 12 hours. Subsequently, dextran was extracted by precipitation by adding 100 ml of 96% ethyl alcohol; the product was weighed and it was determined that for 15 g of sucrose / 100 ml of solution and 0.5 g of yeast extract / 100 ml of solution it is possible to synthesize 3.175 g of dextran / 100 ml of solution equivalent to 28.2% of yield and a final pH of 5.0.
The second phase consisted of 3 series of 24 labeled bioreactors. To each was added 0.5 g of yeast extract and 15 g of blond sugar (99.9% sucrose); 1.0 ml of nutrient salts and gauged to 100 ml with Phosphate Buffer solution at pH 7.5; Then, it was sterilized at 121 ° C for 15 minutes: Then it was removed and cooled to 25 ° C to plant each with 5.0 ml of inoculum (ratio 1:20). Subsequently, it was incubated at 25 ° C for 24 hours.
The extractions were made every hour with 96% ethyl alcohol (in a 1: 1 ratio) and a progress curve was constructed with the data; Determining that after about 15 hours of bioreaction there was a maximum in the production of 3.7 g of dextran / 100 ml of solution, with 33.1% yield and final pH of 5.4.
In the third phase, 3 series of 12 labeled bioreactors were conditioned. To the first was added about 5.0 g; to the second 10.0 g; to the third 15.0 g; to the room 20.0 g; to the fifth 25.0 g; to the sixth 30.0 g; to the seventh 35.0 g; to the eighth 40.0 g; to the ninth 50.0 g; to the tenth 60.0 g; on the eleventh 70.0 g and the twelfth 80.0 g; of crushed molasses (86% sucrose) respectively.
For the enzymatic biosynthesis to be carried out previously, the diluted solutions were partially purified by fractional precipitation with precipitating reagent (NH4) 2 HPO4; then, it was adjusted to an initial pH of 7.5 with 0.03 M NH 4 OH and heated to 75 ° C. Then, it was cooled to 25 ° C, centrifuged, filtered and the precipitate was discarded.
The centrifugation was adjusted to pH 5.5 (maximum enzymatic activity) with 0.01 M HCl according to the final pH of the centrifugation; it was sterilized via UV radiation (2650 A) for one hour to avoid the inversion of sugars; Then, 5.0 ml of crude enzyme was added to subsequently incubate at 25 ° C for 15 hours. At the end of this stage, dextran was extracted with 96% ethyl alcohol; the product was weighed, the progress curve was constructed and it was determined that for 21.5 g of sucrose per 100 ml of solution (25 g of chancaca), it is possible to synthesize 6.2 g of dextran per 100 ml of solution, with a 28.8% yield and a final pH of 5.3.
With the kinetic analysis and the Michaelis - Menten speed laws, the efficiency and specificity of action of the enzyme (dextransucrase) against the substrate (sucrose) was determined. The graph of the Lineaweaver - Burk equation gave us the value of the Km constant equal to 0.07 as a measure of the force of attraction between the enzyme and the substrate ES, which produced an average velocity of 3.8 x 10 -3 µmol dextran / min .; that is, with 23.9 g of sucrose (27.8 g of chancaca) the enzyme produced 6.82 g of dextran / 100 ml of solution (26.2% efficiency)
At higher concentrations of sucrose, the speed of product formation reaches a limit value due to the phenomenon of saturation of the enzyme by the substrate, at the end of which the maximum velocity is 8.0 x 10-an / min. That is to say, with 47.8 g of sucrose (55.6 g of chancaca) 13.6 g of dextran is produced and with a maximum efficiency of the enzyme in the bioprocess of 28.4% with respect to sucrose (24.4 % with respect to chancaca)
Keywords
Chancaca, Leuconostoc mesenteroides, Dextrana